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TUNEL细胞凋亡检测技术服务

原理:

TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况,其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端,并与连接辣根过氧化酶(HRP,horse-radish peroxidase)的链霉亲和素streptavidin特异性结合,后者又与POD底物H2O2、二氨基联苯胺(DAB)产生深棕色反应,特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测?;箍捎τ糜诳怪琢鲆┑囊┬兰?,以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段

实验步骤:

Roche公司试剂盒

1、用二甲苯浸洗2次,每次5min;

2、用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;

3、PBS漂洗2次;

4、用Proteinase K工作液处理组织15~30 min 在21~37 ℃或者加细胞通透液8min;

5、PBS漂洗2次;

6、制备TUNEL反应混合液,处理组用50 μl TdT+ 450 μl 荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50 μl 荧光素标记的dUTP液,阳性对照组先加入100 μl DNase 1,反应在室温~37 ℃×10~30 min,后面步骤同处理组;

7、玻片干后,加50 μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50 μl 荧光素标记的dUTP液)于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×60 min;

8、PBS漂洗3次;

9、可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm,检测波长为515~565nm);

10、玻片干后加50 μl converter-POD于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×30 min;

11、PBS漂洗3次;

12、在组织处加50~100 μl DAB底物,反应15~25 ℃×10min;

13、PBS漂洗3次;

14、拍照后再用苏木素或甲基绿复染,几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片;

15、加一滴PBS或甘油在视野下,用光学显微镜进行计数(200~500个细胞)并拍照

Promega公司试剂盒

1、脱蜡:用二甲苯浸洗5 min×2次;

2、水化:用梯度乙醇(100%×5 min、100%×3 min、95%×3 min、85%×3 min、70%×3 min、50%×3 min);

3、浸洗:0.85% NaCl×5 min→PBS洗5 min;

4、固定:浸入4%多聚甲醛15 min;

5、浸洗:PBS 5 min×2次;

6、细胞通透:用每片100 μl 20 μg/ml Proteinase K处理组织15(10~30) min RT;

7、浸洗:PBS洗5 min;

8、固定:浸入4%多聚甲醛5 min;

9、浸洗:PBS 5 min×2次;

10、平衡:加100 μl 平衡液,湿盒平衡10(5~10)min;

11、制备TUNEL反应混合液:处理组用1 μl rTdT+1 μl 生物素标记的dUTP+98 μl 平衡液混匀;而阴性对照组不加rTdT,改为三蒸水;阳性对照组先加入100 μl DNase 1 缓冲液孵育5 min,甩掉液体后再加100 μl DNase 1(10 U/ml)酶切10 min,用去离子水冲洗4次,PBS浸洗5 min,后面步骤从第10步开始;

12、标记反应:加100 μl TUNEL反应混合液于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×1 h;

13、终止反应:浸入2×SSC 15 min;

14、浸洗:PBS 5 min×3次;

15、封闭POD:浸入0.3% H2O2 15 min;

16、浸洗:PBS 5 min×3次;

17、酶标反应:加100 μl streptavidin标记HRP(按1:500 PBS稀释)30 min;

18、浸洗:PBS 5 min×3次;

19、DAB显色(避光):加100 μl DAB混合液(50 μl DAB+50 μl DAB底物缓冲液+ 50 μl H2O220×+ 950 μl 三蒸水)10 min左右,镜下出现浅棕色背景时;

20、用去离子水冲洗几次;

21、用苏木素复染,3 s左右后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水(50、70、85、95、100、100%各1 min)、二甲苯透明1 min×2次、中性树胶封片。

标本收集及注意事项:

1、标本从取材到固定应在2h以内完成。

2、未打开的试剂盒贮存在-20 ℃,一旦解冻,就保存在4 ℃下,避免反复冻融。

3、初次检测细胞凋亡,最好设置阳性和阴性对照片。

4、假阳性高是TUNEL检测的一个主要缺点。观察TUNEL阳性片是应对照HE切片。结合细胞HE染色来判断阳性的细胞究竟是假阳性还是真正发生了凋亡。

实验结果及数据:

收到标本后15-20个工作日之内将作好的片子交于客户。

基本收费:

60 元/张

做2-3张预实验片

注:客户提供蜡块或者切片及原位杂交试剂盒,公司也代购试剂盒

服务类型 预实验(人工+试剂) 正式实验(人工) 结果内容 备注
HE染色 20元/张 20元/张 染好色的切片 客户提供蜡块或者白片
包埋 30元/蜡块 包埋好的蜡块 客户提供福尔马林浸泡的组织
切片 10元/张,量大从优 切好的白片 客户要求单独切白片时,10元/张,量大从优
免疫组化(石蜡) 60元/张,每个抗体做2-3张预实验片 60元/张,量大从优 染好色的切片 免疫组化实验,客户需提供蜡块或者切片及一抗;WB实验,客户需提供新鲜冰冻组织或者细胞及一抗
WB 1000元/张膜(8个样,一个抗体),内参免费,量大从优 整理好的实验报告及胶片
Tunel 60元/张,做2-3张预实验片 60元/张 染好色的切片 客户提供蜡块或者切片及Tunel试剂盒,公司可代购tunel试剂盒
原位杂交 70元/张,做2-3张预实验片 70元/张 染好色的切片 客户提供蜡块或者切片及原位杂交试剂盒,公司可代购试剂盒
拍照 10元/张切片 电子版照片 100、200、400倍(任选)
Real-time PCR 160元/标本/基因(3次平行反应),内参及引物设计和合成免费 整理好的电子版实验报告 客户提供新鲜冰冻标本(组织或处理好的细胞)及基因中英文全称,其余试剂由公司提供
ELISA 代测费是300元/盒子,常规指标的ELISA试剂盒,公司都有现货,购买这些试剂盒,可免费代测 整理好的电子版实验报告 客户提供收集好的标本(血清、血浆或细胞培养上清等),如果客户标本是组织,需要做组织匀浆和蛋白定量,组织匀浆是12元/标本,蛋白定量是200元/次